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細胞的復蘇及凍存方法

更新時間:2012-03-27      點擊次數:5021

細胞的復蘇及凍存方法

一. 細胞復蘇與培養
將液氮或- 80℃ 保存的腫瘤細胞于 37℃ 水浴,快速溶化,用 8.0ml 培養基混勻已融化的腫瘤細胞懸液,于 1500 轉/ 分,離心 3 分鐘。 棄上清,再吸取 8.0ml 培養基質混勻細胞沉淀,再 1500 轉/ 分,離心 3 分鐘,棄上清,細胞沉淀用 1.0ml 培養基混勻,備用。 另取一個 75cm2 方瓶,加入 14.0ml 培養基質,將上述制備的含 腫瘤細胞懸液(1.0ml)加入此方瓶中,于 37℃,5%CO2 孵育箱中培養。
若此腫瘤細胞懸浮生長,大約 3-4 天細胞基質會變黃,5.0ml 細胞懸液可傳代一個方瓶培養,可用 3-4 個方瓶培養,一個方瓶中呈對數生長的腫瘤細胞可達 1-1.5×107 個,根據試驗所需,可決定傳代的次數。 若此腫瘤細胞呈貼壁生 長,經過 3-4 天,腫瘤細胞生長至 80%-95% 單層時,棄上清,用 0.5mM 的EDTA(難消化的腫瘤細胞用0.25%胰酶1.0ml),處理腫瘤細胞大約 3-5 分鐘,用倒置顯微鏡觀察,當 90% 的腫瘤細胞變圓時,即可用彎管吹打并將消化的細胞轉移到 15ml 離心管中,于 1500 轉/ 分下,離心 3 分鐘,棄上清,加少許培養基混勻,可傳代 3 個 75cm2 方瓶擴大培養。

二. 細胞凍存
將對數生長的腫瘤細胞用 1 個 75cm2 方瓶按上述方法收集,于 1500 轉/分離心 3 分鐘,棄上清,用保種液( 含 10% DMSO 的小牛血清)3.0ml 混勻,分別加入到 2-3 只保種管中,寫上腫瘤細胞名稱、時間、保種者姓名,放- 80℃ 保存,次日將它們轉移到液氮中保存( 注: -80℃ 下可保存細胞半年至一年,液氮可保存細 胞 5-10 年,甚至更長的時間)。以上所有物品均需經過高溫滅菌 ( 121℃,30 分鐘) ,培養基質則經過過濾(0.22uM)除菌,所有操作均必須遵守無菌操作技術,避免細菌、真菌、病原體、衣原體等污染。
 

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